Η Δέσποινα Στυλιανοπούλου γεννήθηκε στη Μεσσήνη το 1937. Σπούδασε φωνητική στο Ελληνικό Ωδείο και υποκριτική στη Δραματική Σχολή Δημήτρη Ροντήρη, απ' την οποία και αποφοίτησε το 1959.

Την ίδια χρονιά εμφανίστηκε με το Πειραϊκό Θέατρο του Δημήτρη Ροντήρη στην τραγωδία "Ηλέκτρα". Παράλληλα παρακολούθησε μαθήματα στη Νομική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών.

Στον κινηματογράφο έκανε την πρώτη της εμφάνιση το 1961 στην πολεμική ταινία της Έλλης Νεζερίτη «Ο Ξένος της Νύχτας». Την ίδια χρονιά εμφανίστηκε σε ένα μικρό ρόλο και στην ταινία «Η Αλίκη στο Ναυτικό» του Αλέκου Σακελλάριου.  Αν και έλαβε μέρος σε αρκετά δράματα καθιερώθηκε στη κωμωδία και έγινε πολύ δημοφιλής στον ρόλο της επαρχιώτισσας υπηρέτριας. Μέχρι σήμερα έχει λάβει μέρος σε 58 ταινίες. Μερικές από αυτές είναι οι «Μην ερωτεύεσαι το Σαββάτο(1962)», «Τα δίδυμα (1964)», «Ο εξυπνάκιας(1966)», «Η αρτίστα(1966)», «Εισπράκτωρ 007(1966)», «Το πιο λαμπρό αστέρι(1967)», «Σαπίλα και αριστοκρατία(1967)», «Πατέρα κάτσε φρόνημα(1967)», «Ο γεροντοκόρος(1967)», «Η χαρτορίχτρα(1967)», «Δημήτρη μου Δημήτρη μου(1967)», «Αχ αυτή η γυναίκα μου(1967)», «Το κορίτσι του λούνα παρκ(1968)», «Ο τρελλός τα 'χει 400(1968)», «Καπετάν Φάντης Μπαστούνι(1968)», «Η αγάπη μας(1968)», «Τρεις Τρελλοί για δέσιμο(1969)», «Το αφεντικό μου ήταν κορόιδο(1969)», «Ο τζαναμπέτης(1969)», «Ο μπλοφατζής(1969)», «Ξύπνα καημένε Περικλή(1969)», «Η αρχόντισσα της κουζίνας(1969)», «Ένας μάγκας στα σαλόνια(1969)», «Ο γίγας της Κυψέλης(1969)», «Φουκαράδες και λεφτάδες(1970)», «Ο νάνος και οι επτά Χιονάτες(1970)», «Η ταξιτζού(1970)», «Ο Μανωλιός ξαναχτυπά(1971)», «Η εφοπλιστίνα(1971)», «Ένα αγόρι αλλιώτικο από τ' άλλα(1971)», «Η προεδρίνα(1972)», «Δουλικό αμέσου δράσεως(1972)», «Απ' τα αλώνια στα σαλόνια(1972)»κ.α.. .

Στο θέατρο διακρίθηκε ιδιαίτερα σε έργα πρόζας αλλά και στην επιθεώρηση. Από το 1973 υπήρξε πολλές φορές θιασάρχης στο θέατρο Αυλαία του Πειραιά. αξιοποιώντας τη μεγάλη επιτυχία στον κινηματογράφο.